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  《宁波农业科技》
水产品中生物毒素免疫检测技术研究进展
作者:张亮    更新时间:2017-03-29 点击数:1013
 水产品中生物毒素免疫检测技术研究进展

张亮,赵健,付岩,朱勇,章豪,吴银良

(宁波市农业科学研究院  315040

摘要:本文简要综述了水产品中常见生物毒素免疫检测技术的发展情况,包括生物毒素免疫原的制备、抗体的制备以及免疫学检测方法的建立,同时阐述了水产品中生物毒素检测技术面临的问题,并对未来水产品中生物毒素检测技术的发展前景进行了展望。

关键词:生物毒素;免疫检测;水产品

1 前言

水产品是海洋和淡水渔业生产的动植物及其加工产品的统称。我国湖泊众多,海岸线绵长,随着我国交通和保鲜技术的发展,运输能力日益增强,这极大地促进了水产品的消费量,使水产品摆上更多内陆老百姓的餐桌成为可能。水产品以其丰富营养与较高药用价值备受人们青睐,使得其市场和消费群体逐步扩大,需求量逐年增加;但因近些年来随着城市化和工业化的发展,出现了水体环境的污染和富营养化,近海赤潮不断发生,带来水产品的污染以及引起贝类的毒化和鱼类的大量死亡,间接对人类造成极大的危害。全世界每年由有毒鱼、贝类引起的食物中毒事件都超过2万件,死亡率为1%。水产品质量安全问题日益突出。

水产品质量安全问题大多是由生物毒素引起的,而水产品中的生物毒素影响比较大、研究比较多的主要有河豚毒素tetrodotoxin,TTX、贝类毒素和雪卡毒素(ciguatoxin,CTX。这些生物毒素会对人和动物的呼吸系统、消化系统和神经系统带来不同程度的危害,甚至引起死亡。生物毒素导致的水产品质量安全问题日益得到人们的重视,针对水产品中生物毒素的检测技术也得到了快速发展,其中以生物法、免疫学分析法及仪器分析法最为普遍,免疫学分析技术以其灵敏度高和操作简单等优点成为快速筛选的首选方法,得到了广泛的研究和应用。

免疫检测技术的基本原理是通过抗原、抗体的高度特异性反应和抗原、抗体上的标记物(酶、荧光物质、放射性同位素、芯片)的生物、物理或者化学信号放大作用来实现对微量目标物的定性定量检测。经过近几十年的发展,逐渐形成了以酶联免疫吸附测定技术(enzyme linked immunosorbent assayELISA)和胶体金免疫层析技术(gold immunochromatography assayGICA)为主体的快速免疫检测技术[1]。本文着重从免疫分析方法方面介绍水产品中生物毒素检测技术及其最新研究进展以期为水产品中生物毒素免疫检测技术研究提供参考。

2  免疫检测技术在生物毒素中的应用现状

2.1 河豚毒素免疫检测技术研究现状

河豚毒素是毒性最强的非蛋白类神经毒素之一,它属于生物碱类天然毒素,存在于很多海洋生物体内。河豚毒素的免疫检测分析技术的基础是单克隆抗体的研制技术,河豚毒素属于小分子物质,本身不具有免疫原性,需将其在偶联剂的作用下与大分子载体蛋白(常用的有BSAOVAKLH等)偶联获得完全抗原。早在上个世纪八十年代末期,Watabe[2]人就首次利用河豚酸与牛血清蛋白(bovine serum albuminBAS)的偶联得到免疫抗原,并采用小剂量长周期的免疫方案制备出了单克隆抗体。Rayboald[3]用匙孔型血蓝蛋白(keyholelimpethemocyan-inKLH)作为偶联蛋白制备出灵敏度高、特异性强的单克隆抗体,建立的直接竞争ELISA检测法的最低检测限为2~3μg/mL,间接竞争ELISA法的最低检测限也达到了30μg/mL,满足了河豚毒素免疫检测的基本要求。Kawatsu[4,5]利用BSA和河豚毒素偶联得到完全抗原,制备了单克隆抗体,并建立了河豚毒素免疫亲和层析色谱检测法与HPLC荧光检测相结合的定量检测技术,该方法的最低检测限为2ng/mL,但是该方法的缺陷是检测范围窄,只适用于微量河豚毒素的定量检测。Matsumura[6]利用亲和素-辣根过氧化物酶标记抗河豚毒素的单克隆抗体,建立的间接竞争ELISA方法的最低检测限达到0.05ng/mL,线性范围为0.5~50ng/mL。国内学者也对河豚毒素的免疫检测技术进行了长期不懈的研究。王健伟等[7]通过优化样品前处理条件,间接竞争ELISA的最低检测限达到了1ng/mL,该方法操作简单,省去了复杂的柱层析净化过程。Zhou[8]用纳米金颗粒标记McAb,研制出胶体金试纸条,检测时间仅需10min,使样品检测更加方便快捷。之后苏捷等[9]研制出TTX胶体金免疫层析试剂盒,其检测时间仅需5~12min,更重要的是该检测卡常温可以保存12个月,这就大大提高了免疫层析技术的实用性。

2.2 贝类毒素免疫检测技术研究现状

贝类毒素是对水产品危害最大、最广泛的一类海洋生物毒素,同时也是水产品生物毒素中研究最多的毒素。常见的贝类毒素主要包括麻痹性贝类毒素(paralytic shellfish poisonPSP、腹泻性贝类毒素(diarrhetic shellfish poisonDSP、神经性贝类毒素(Neuro-toxic Shellfish PoisoningNSP)、遗忘性贝毒(Amnescic Shellfish PoisoningASP)等。

2.2.1麻痹性贝类毒素的免疫检测技术

麻痹性贝类毒素中石房蛤毒素(STX)是毒性最强,提取纯化最早的毒素,它也是麻痹性贝类毒素的主要成分,目前商业化的ELISA试剂盒也主要是针对STXDubois[10]通过用STX的偶联物免疫获得的抗体,建立了间接竞争ELISA方法,该方法采用90%的乙醇溶液来提取贝类组织中的STX,最低检测限为5μg/kgJellett[11]通过样品中的PSP毒素与结合到检测线上的毒素竞争结合标记的抗STX抗体的原理发明了横向流动色谱法检测试纸条,该方法能够起到检测贝类中PSP毒素的作用,但是其精确性和可重复性比较差。胡盼[12]利用成功获得的能够模拟STXSTX抗体结合的适配子,并基于靶标诱导变构解离SELEX筛选模式,建立了一种适配子变构解离的STX无毒ELISA检测方法,这为无毒快速检测试剂盒的研究和开发提供了实验基础。

2.2.2腹泻性贝类毒素的免疫检测技术

基于单克隆抗体的腹泻性贝类毒素免疫检测技术研究开始于二十世纪八十年代后期。在世界范围内得到了广泛应用。日本UBE公司生产的腹泻性贝类毒素-Check试剂盒被广泛应用于OA和鳍藻毒素(dinophy sistoxins,DTX-1)的检测,检测限可达到20ng/mL。美国ABRAXIS腹泻性贝类毒素试剂盒,检测时间短,检测限为0.1ng/mL[13]。另一种商品化的DSP试剂盒Rougier Bio-Tech是利用单克隆抗体进行酶联免疫吸附检测,该方法表现出相对较好的交叉反应活性。李军涛等[14]建立的腹泻性贝类毒素免疫荧光层析试纸条检测法的检测下限小于125ng/mL,该方法与液相色谱串联质谱法相关性大于0.95,并且具有高度的特异性。

2.2.3神经性贝类毒素的免疫检测技术

短裸甲藻毒素(BrevetoxinBTX)是神经毒素中重要的一种,目前免疫检测技术已经实现了对短裸甲藻毒素的检测,国外已经研究制备了抗BTX的单克隆抗体,并建立了直接竞争ELISA检测方法,其步骤大致如下:用抗血清对ELISA板进行包被,并将其置于0.05mol/L的碳酸氢钠缓冲液中室温过夜;用PBS洗板,1%的牛血清蛋白封闭培养1hPBS洗板后放置4℃冰箱保存;检测样品时将50μL样品提取液或PbTx标准物分别同50μL LBTx-3-HRP溶液一起加入96孔板中,20~25℃培养3h,之后用PBST洗板4次,再用PBS冲洗4次;立即加入增强/吸收试剂(ELAST)于孔室中,将生物素酪胺溶液(Biotinyl tyramide)(100μL/)吸入孔室中培养15min;然后加入辣根过氧化物酶溶液(100μL/)培养30min;甩板后依次用PBST冲洗4次,PBS冲洗4次。再加入10mL底物(TMB)溶液培养15min;之后加入50uL 2mol/L硫酸溶液终止反应,使用微平板分光光度计于450nm下检测吸光率,该方法检测结果可靠又精确。此外,Garthwaite还提出了一套针对NSP毒素的ELISA检测法,对PbTX-3有检测限为0.53mg/mL,其优势是可以直接分析海水。

ASP的免疫检测技术目前还处于研究的初级阶段,直到现在仍然没有商品化的免疫检测试剂盒[15],但是,随着对ASP分子结构和毒性机理的深入研究,针对其的检测技术有望实现突破。

2.3 雪卡毒素免疫检测技术研究现状

雪卡毒素可沿着食物链进行传递和积累,最后引起人类食源性疾病,是目前世界上报道最多的海洋生物毒素性疾病之一[16,17]Hokama[18]最早通过免疫绵羊制备出多克隆抗体,先后通过放射免疫分析(RIA)和ELISA法检测到牛血清蛋白偶联的雪卡毒素。张彩霞等[19]以雪卡毒素的结构类似物莫能菌素为半抗原,采用琥珀酸酐法将其改造成莫能菌素-琥珀酰半酯(MONHS),再用混合酸酐法将其与大分子载体牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,成功制备出了雪卡毒素人工抗原MBSAMOVA,并通过免疫小白鼠成功筛选到了分泌雪卡毒素抗体的细胞株。Tsumuraya[20]通过制备的单克隆抗体,建立的直接夹心酶联免疫检测法检测CTX-3C51-hydroxy CTX-3C,灵敏度可以达到ppb级,并且特异性很高。目前, 国内外对雪卡毒素的测定主要采用美国Oceanit Test SystemsInc.公司研制的免疫膜测定试剂盒,该试剂盒的最低检测限为0.05μg/kg,操作简便、快速,适用于现场的快速检测,但是也存在假阳性等问题。虽然现在针对雪卡毒素的检测方法还不够成熟完善,但是以抗原-抗体为基础的免疫学检测方法最适于发展建立现场快速检测诊断的检测方法,是今后雪卡毒素检测以及中毒诊断的发展方向。

水产品中生物毒素免疫检测技术面临的问题及展望

3.1 面临的问题

目前, 水产品中生物毒素已经成为世界上水体环境工作者的研究热点,但是我国所做的研究工作相对较少具有自主知识产权并能够市场化的水产品生物毒素抗体还很少,痕量生物毒素的检测也亟待完善随着科研的进一步深入新的生物毒素不断被发现,这些生物毒素的毒理学性质研究、毒素纯品的提取制备,将是免疫检测技术的关键和基础。 因此 毒素标准(不是纯品吗???)的获取或者替代物的合成也是我们所面临的亟待解决的问题。此外,生物毒素大都是小分子物质,而小分子的半抗原不利于诱导产生高亲和力抗体[21-24]。因此设计和改进生物毒素人工抗原是获得高质量抗体的重要途径。

虽然免疫学方法检测水产品中的生物毒素的技术已经得到了初步的应用。但是生物毒素抗体的制备仍然限制着该技术的深入应用。目前报道的抗体往往只是针对某一种毒素所建立,因而对于其他生物毒素常表现出较低的交叉反应不能检测一类或者多种生物毒素。这就会导致对某一种生物毒素进行检测时,可能产生假阳性或者过高的估计值,而对于样品中生物毒素的估计值又远远小于实际值,造成较大的评价误差。这就要求我们必须研制针对某一类化合物的通用抗体来进行多组分、多残留免疫分析。

3.2 展望

近年来,随着生产技术的进步和人们生活水平的提高,人们对水产品的需求量越来越大,但同时也对水产品中生物毒素的检测提出了更高的要求,适用于现场应用、准确、快速、高效、操作简便并且单样本检测成本低廉的检测方法是未来科研工作者的研究方向。从目前发展情况看,传统的检测技术难以满足这些需求,免疫快速检测技术最为接近上述要求,必将成为水产品中生物毒素快速筛选的首选方法。同时,传统的真菌毒素(如黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、T-2毒素等)和很多农药的免疫快速检测技术已经非常成熟[25-30],这为水产品中生物毒素的快速检测方法开发提供了理论基础和实践经验。相信不久的将来,水产品中生物毒素免疫检测技术将日趋成熟,性能优良的生物毒素免疫检测产品也将很快在国内外问世,以保障人们的饮食安全。

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